DISEÑO DE OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES (Primers)

Autor: Diego Mauricio Riaño Pachón

---

General	Programas
Cebadores para PCR o secuenciación	Bibliografía
Temperatura de Asociación

---

General (1)

La selección de oligonucleótidos iniciadores es muy importante en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés), en la hibridizaciòn con sondas y en la secuenciación de ADN.  De este paso depende el éxito en el laboratorio.
Principales Criterios
 

Tamaño	Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud  generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud
Base en el extremo 3'	Debe ser una  G o una C
Temperaturas de fusión (Tm)	50-65 ºC
contenido GC	40-60%
auto-complementariedad	Debe ser evitada  Para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dimeros de primer
Similaridad	Debe tener un 100% de apareamiento con el molde

Cebadores para PCR o para Secuenciación

PCR:

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posición de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminación.  Es recomendable que el cebador  "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la región que codifica.
 

SECUENCIACIÓN

Cuando el objetivo es obtener la secuencia de ADN es recomendable que los cebadores se localicen por lo menos 50 pb antes de la región que se desea secuenciar, esto para el cebador "forward" cuando hay uno, y 50 pb despues de la región a secuencias para el cebador "reverse", cuando hay uno.
Es importante que el fragmento a secuenciar no sea muy grande, debido a que los errores de lectura de secuencia aumentan cuando los fragmentos son grandes, si es necesario secuenciar un fragmento muy largo, es conveniente diseñar cebadores internos, para obtener la secuencia en dos partes y luego ensamblarla.

Temperatura de Asociación

La temperatura de asociación de los cebadores es uno de los factores mas determinantes de la reacción.  Se recomienda que se emplee  como temperatura de asociación la temperatura de fusión -5ºC, aproximadamente.  Existen muchos métodos para calcular la temperatura de fusión, pero siempre, despues de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción.
 

Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) (2)

Existen muchos métodos para estimar el valor de la temperatura de fusión.
Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximación:

 Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C)

donde se asume una concentración de sal de 0.9M, tipica de "dot blot" y otros ensayos de hibridización
A continuación tenemos otra expresión para el calculo de Tm

Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M],

donde L se refiere a la longitud del oligonucleótido, y [M] es la concentración de cationes monovalentes.  Esta fórmulas es unicamente aplicable a asecuencias polinucleotidicas largas.

El método mas preciso para estimar la Tm de oligonucleótidos está basado en el análisis termodinámico del proceso de fusión del cual se puede mostrar que,

Los cambios en la entalpia() y la entropia() de la formación del duplex se calculan a partir de parametros termodinámicos de vecindades.  R es la constante molar de los gases (1.987 cal.K-1mol-1), y C es la concentración molar del oligonucleotido. Se puede adicionar un secundo término a la ecuación anterior para tener encuenta el efecto estabilizante de la sal sobre el duplex:

Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los margenes del error experimental.

Programas de Diseño de Primers

Primer3
Primer Selection
NetPrimer
 

Bibliografía

1. - Human Genome Maping Project. Primer Desing  (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/MANUAL/faq/faq-primers.html)
2. - Integrated DNA Technologies. Calculation of Tm for Oligonucleotides (http://www.idtdna.com/html/tech/tmcalc.html)